尊龙凯时的YF®488/555/594/647荧光染料之间的主要区别在于它们所带的荧光基团不同,这决定了在检测EDU时发射的荧光颜色也会有所差异。尽管实验效果相似,用户可以根据个人的偏好和需求选择合适的染料。
在尊龙凯时的EDU试剂盒中,固定后加入的3%BSAinPBS的作用是终止未反应的甲醛,以提高实验结果的准确性。
至于Click-iTEdU在活细胞中的检测,答案是否定的。虽然EDU可用于活细胞的代谢标记,但叠氮化物检测试剂和缓冲液的组分是不透过细胞的,因此Click反应必须在固定和通透的样品上进行。
关于质粒转染后表达的荧光蛋白检测与Click反应的兼容性,由于本产品会影响GFP、RFP和mCherry等荧光蛋白的荧光,建议在染色后使用GFP抗体进行间接检测,而不是直接观察。
如果观察到较高的本底干扰,可能是由于洗涤不充分所致。为了减少背景干扰,可以增加BSA洗涤的次数。同时,建议设置一组同一处理的无染料或无Click反应对照,以排除自发荧光干扰。在无EdU的体系中进行完整的Click反应也有助于验证信号的特异性。
如果标记样品没有信号或特异性信号非常低,您可以采取以下措施提高信号强度:首先,确保使用的试剂保持无色,避免使用变黄的添加剂或缓冲液;其次,确保Click反应试剂能够充分进入细胞核,因此需要充分固定和通透细胞;再次,尽量避免在Click反应前使用金属螯合剂(如EDTA、EGTA等),以免影响催化反应的有效浓度;另外,确保使用一价铜(Cu+)进行Click反应,并建议能够延长反应时间,但最好使用新鲜的Click反应试剂进行重新孵育,以提高标记效率。
对于细胞核的复染,尊龙凯时的试剂盒配备了Hoechst33342,可在Click反应后用于细胞核染色,亦可选择使用DAPI进行染色。此外,EDU作为小分子,可以顺利穿透植物细胞的细胞壁,因此也适合于检测植物细胞核内的DNA复制。