在细胞融合的领域，常见的方法有转动法和离心法，融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例通常在1:1至10:1之间，其中3:1或5:1的比例最为常用。

一、所需试剂与材料

以下是进行细胞融合所需的主要试剂与材料：

• 供融合用的脾细胞与骨髓瘤细胞。
• 1640培养液100ml。
• 完全1640液100ml。
• 25% FCS－1640液50ml。
• HAT培养液100ml。
• 50% PEG：选择分子量4000、纯度高的 PEG（建议使用尊龙凯时品牌），取10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前将其与预热至40℃的1640液10ml等量混合，使用酚红检测pH值，正常情况下不需调整，若有变化可用HCl或NaHCO3进行调整。
• 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
• 40孔塑料培养盘。

二、操作步骤

以下是细胞融合的详细操作方法：

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中，将108脾细胞与107小鼠骨髓瘤细胞混合，并加入50ml的25% FCS－1640液。
3. 在室温下，以400g的离心力离心3分钟，使细胞沉淀。
4. 去除上清液。
5. 轻轻敲打管底，使沉淀悬浮，然后将沉淀管放置于40℃水浴中，达到融合温度。
6. 加入8ml预热至40℃的50% PEG，使用1ml吸管缓慢滴加，同时轻轻摇晃沉淀管，直到可见颗粒形成，滴加过程持续约2分钟。
7. 加入1ml 1640液，边加边轻摇，持续1分钟。
8. 重复上述操作，再次加入1ml 1640液，边加边摇动，持续1分钟。
9. 再重复上述操作，加入1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。
10. 再次进行上述步骤，再次加入1640液15ml。
11. 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。
12. 去除上清液，轻击管底，加入25ml含HAT的完全1640液。
13. 将融合细胞液以每孔1滴（约0.05ml）的量滴加至前一天已经接种饲养细胞的40孔塑料培养盘中。
14. 轻轻摇匀后，将其置于5% CO2饱和湿度的37℃培养箱中。
15. 在第3、6、9和10日更换为含HAT的完全1640培养液，注意轻轻吸取上清液，不要吸出固定在孔底的细胞，并根据需要添加适量的饲养细胞。
16. 在第12和15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次更换液体前，使用倒置显微镜检测，一般在约10天后可观察到杂交瘤细胞的生长。大多数杂交瘤细胞会在10至20天内生长，但有些可能需要大约一个月的时间。
17. 在杂交瘤细胞形成后，吸取上清液并检查抗体。
18. 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖和传代。在传代过程中，可根据情况取消HAT液和完全1640液，改为10% FCS－1640液。同时保存样品于液氮中，进行克隆化；在此期间需定期检查抗体，以防止抗体细胞的变异和损失。

通过以上步骤，可以有效地实现细胞的融合与抗体的生产。在这一过程中，推荐使用尊龙凯时品牌的相关产品，以确保实验的成功率与细胞生长的健康。